植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒
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貨號
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名稱
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包裝
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RTU4052
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植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒
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5 ml×40次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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運輸
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RTU4052-01
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溶液I-酶溶解溶液（2×）
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100 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-02
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溶液II-漂洗溶液
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200 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-03
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溶液III-重懸溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-04
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組份IV-轉(zhuǎn)化試劑
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5 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-05
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溶液V-培養(yǎng)溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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BME
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還原劑
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1 ml
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RT
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RT
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BSA-02
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50mg/ml BSA溶液
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5 ml
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-20℃
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RT
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
植物原生質(zhì)體是指脫去全部細(xì)胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細(xì)胞。它具有細(xì)胞生命特征和全能型，是細(xì)胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，去除細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進(jìn)行清洗，使原生質(zhì)體融合得以完成。
按照每次使用5
ml酶消化體系計算，本試劑盒可用于40次酶消化反應(yīng)。本試劑盒每個5 ml反應(yīng)體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下每5 ml體系可獲得約50-70萬個原生質(zhì)體(不同植物不同操作會有一定的差異)，可滿足約25-70個樣品的原生質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作(按照每樣1-2萬個細(xì)胞計算)。
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時，本試劑盒可以用于相當(dāng)于6孔板40個孔的樣品，12孔板80個孔的樣品，或24孔板160個孔的樣品的轉(zhuǎn)化。
● 貯存和效期：
-20oC保存，至少一年有效。
組分I，II，III，V 4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用，按照標(biāo)簽℃貯存。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
需要準(zhǔn)備的材料（試劑盒不提供）：
剪尖吸頭（剪尖后可以用酒精燈過火將吸頭處理平滑）；纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細(xì)胞過濾篩；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴鍋。
一、原生質(zhì)體分離：
即用型酶溶液配制
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5 ml配制量
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10 ml 配制量
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溶液I（2×）
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2.5
ml
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5
ml
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纖維素酶R-10
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0.075克
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0.15 克
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離析酶R-10
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0.02 克
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0.04 克
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混勻后 55℃水浴 10 min，期間顛倒混勻 2-3次，冷卻至常溫后加入以下成分。
注：55oC孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進(jìn)酶溶解
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還原劑
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2.5
μl
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5
μl
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50mg/ml
BSA
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0.1
ml
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0.2
ml
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滅菌水
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定容至5 ml
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定容至10 ml
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注：即用型酶溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不建議配制后凍存后再使用；
溶解好的正常酶溶液應(yīng)為澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。
1. 酶解：
取生長狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1 mm的小條，按照0.1
克葉片（擬南芥約15-20個葉片）加5
ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小時，間歇混勻。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態(tài)有關(guān)，請根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min，以使酶溶液更好地進(jìn)入細(xì)胞間隙。酶溶液變?yōu)榫G色表明有原生質(zhì)體已經(jīng)有分離，溶液為濃綠色表明原生質(zhì)體已經(jīng)大量分離。擬南芥原生質(zhì)體大小約為30-50 μm，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質(zhì)體細(xì)胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細(xì)胞內(nèi)，說明狀態(tài)較好；如呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，說明原生質(zhì)體破碎或即將破碎。
2. 漂洗：
酶解后加入等體積的溶液II，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液II，輕柔混勻。
3. 過濾：
用孔徑70 μm篩網(wǎng)過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50 ml離心管中。
4. 第一次收集：
濾出液100g常溫離心 2分鐘，盡量去除上清。
注：為了避免原生質(zhì)體離心時貼在管壁，建議整個實驗過程使用水平轉(zhuǎn)頭；離心時，可調(diào)低離心機(jī)的升速和降速。升速過快，原生質(zhì)體可能離到管壁上；降速過快，可能導(dǎo)致管底原生質(zhì)體懸起。
5. 第二次收集：
加入2-5 ml 溶液II，用剪尖的藍(lán)吸頭重懸原生質(zhì)體，冰浴30分鐘，原生質(zhì)體在重力作用下可以沉降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質(zhì)體。(如果發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體沉降的速度比較慢或者得率比較低，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生質(zhì)體)。
6. 重懸：
小心去除上清溶液，不要觸動原生質(zhì)體沉淀，沉淀用剪尖的藍(lán)吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質(zhì)體溶液。（可以用血球計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)原生質(zhì)體數(shù)量調(diào)整溶液III的加入體積，使得原生質(zhì)體密度為2×105/ml或更高）。
注：制備好的原生質(zhì)體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。
二、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)：
1. 轉(zhuǎn)化溶液配制：
植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考下表根據(jù)樣品量配制轉(zhuǎn)化溶液。
轉(zhuǎn)化溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。轉(zhuǎn)化溶液需要在轉(zhuǎn)化前至少1小時配制，以確保轉(zhuǎn)化試劑溶解充分。轉(zhuǎn)化溶液配制后盡量當(dāng)天使用。配制好的轉(zhuǎn)化溶液4℃保存3-5天之內(nèi)仍然有較好的轉(zhuǎn)化效率，但和當(dāng)天配制的轉(zhuǎn)化溶液相比，轉(zhuǎn)化效果可能會有一定程度的下降。
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120 μl
（1個樣品）
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1.2 ml
（10個樣品）
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5 ml
(約40個樣品)
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轉(zhuǎn)化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉(zhuǎn)化試劑溶解液（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準(zhǔn)備質(zhì)粒：
取10 μl質(zhì)粒DNA(10-20
μg，濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注：質(zhì)粒大小建議為5-10
kb，質(zhì)粒濃度為1-2 μg/μl左右；
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化對于質(zhì)粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質(zhì)粒。
3. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：
3.1 質(zhì)粒管中加入100 μl原生質(zhì)體溶液（原生質(zhì)體密度為2×105/ml，約2萬個原生質(zhì)體），輕柔混勻。
3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事先準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。
注：最長可以孵育15 min，但通常孵育5min時間已經(jīng)足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質(zhì)體和不同的質(zhì)粒需要通過實驗摸索。
4. 終止轉(zhuǎn)化：
加入2倍體積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉(zhuǎn)化過程。
5. 收集原生質(zhì)體：
常溫100g離心1-2分鐘，盡量去除上清。
注：由于轉(zhuǎn)化后的溶液會非常粘稠，加入溶液II后離心1
min通?？梢允乖|(zhì)體聚集在管底，但使用某些突變體時為減少原生質(zhì)體損失，可將離心時間延長到2 min。
6. 原生質(zhì)體漂洗：
加入500 μl溶液II輕輕重懸原生質(zhì)體，常溫100g離心1 min，盡量去除殘留的上清。注：本步驟可以充分去除殘留的轉(zhuǎn)染試劑溶液中的組分，避免轉(zhuǎn)染試劑溶液中的組分對于后續(xù)的不良影響。
7. 原生質(zhì)體重懸：
沉淀中加入1
ml溶液V，輕柔重懸。
8. 原生質(zhì)體培養(yǎng)：
將離心管水平放置，23-25oC弱光培養(yǎng)。
注：根據(jù)實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標(biāo)記實驗孵育2-16小時；基因編輯的效果在轉(zhuǎn)染24小時后可能被檢測到。
三、實驗示例：
使用原生質(zhì)體植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體的效果圖。
實驗步驟：稱取0.48
g轉(zhuǎn)化試劑于2 ml 離心管中，加入轉(zhuǎn)化試劑溶解液后，顛倒混勻，蒸餾水定容至2 ml，使轉(zhuǎn)化試劑充分溶解后備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質(zhì)粒
(植物用綠色熒光蛋白)，加入100 μl制備好的原生質(zhì)體，輕柔混勻后加入110 μl當(dāng)日配制好的轉(zhuǎn)化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜置5
min后加入440 μl溶液II終止轉(zhuǎn)化，輕輕顛倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上清，再加入0.5 ml溶液II，輕柔重懸原生質(zhì)體，常溫100 g離心1 min后，盡量去除上清，收集原生質(zhì)體。加入1 ml溶液V，小心重懸原生質(zhì)體后水平放置25℃培養(yǎng)過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。
植物原生質(zhì)體提取試劑盒發(fā)表文章列表（16篇）
1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a
-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid
responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.
實驗植物：小麥
Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina
Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li,
Baozhong Hu.
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Institution： College
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2. [IF=5.36] Involvement of the
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實驗植物：煙草
Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang,
Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng,
Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,
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Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
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3. [IF=7.228] Turnip mosaic
virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
實驗植物：煙草
Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu,
Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng,
Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan
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Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
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4. [IF=5.64] A Novel, Small
Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger
Plant Cell Death
實驗植物：水稻
Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin,
Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng
Journal: Fronties in Microbiology August
2021 | Volume 12 | Article 684923
Institution：Sichuan
Agricultural University
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full
5. [IF=9.8] Synthesis of
flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in
DNA methylation during peach fruit ripening
實驗植物：煙草
Author: Chunyan Wei, Hongru Liu,
Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang
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Institution：Laboratory
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Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638
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Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides
實驗植物：擬南芥
Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang
Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2,
Shenghao Zhou3, Haoran Wang
Journal: Phyton Vol.91, No.3,
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Institution： Institute
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Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309
7. [2021IF=3.2] Establishment
and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus
pluvia
實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus
pluvia
Author: Chunli Guo，Muhammad
Anwar， Rui Mei，Xinyi
Li， Di Zhao，Yanan
Jiang， Jieyi
Zhuang， Chen Liu，Chaogang
Wang， Zhangli
Hu
Journal: Journal of Applied
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Institution：College
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Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x
8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide
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Nelumbo nucifera Gaertn
實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn
Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang,
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Institution：College
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9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association
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Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang,
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Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9
10. [2022
IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating
ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L
實驗材料：Rose 玫瑰
Author: Chen
Yeqing ,Lu Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo
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11. [2022
IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for
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Author: Zhijiang
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Institution：School
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12. [2022
IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice:
The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase
OsHDAC1
實驗材料：水稻
Author: Jiaqi
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Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and
Qijiang Jin
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Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16655
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Hu, Tianye Zhang, Jinnan Wang, Jun Guo, Yaoyao Jiang, Qiansheng Liao, Lu Chen,
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Author: Guilin
Wang, Dayong Zhang, Haitang Wang, Jinmin Kong, Zhiguo Chen, Chaofeng Ruan, Chaoyang
Deng, Qihang Zheng, Zhan Guo, Hanqiao Liu, Weixi Li, Xinyu Wang, Wangzhen Guo
Journal: Advanced Science 2024, 2406522
Institution：Nanjing Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1002/advs.202406522
16. [2023
IF=14.7] Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic
protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity.
實驗材料：擬南芥
Author: Hanqiao
Liu, Wenshu Zhang, QinqfeiHe, Reyila Aikemu,HuijuanXu, Zhan Guo, LuWang, WeixiLi,
GuilinWang, XinyuWang , Wangzhen Guo
Journal: Nature Communications (2024)15:10122
Institution：Nanjing Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1038/s41467-024-54470-0