昆蟲(chóng)基因組DNA提取試劑盒
Insect
Genomic DNA Isolation Kit
● 試劑盒內(nèi)容及保存：
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試劑盒組成
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RTG2408
（50次）
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貯存方式
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緩沖液IL
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22
ml
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常溫
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緩沖液IB（濃縮液）
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26
ml
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常溫
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緩沖液LF
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16
ml
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常溫
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DNA
Wash Buffer (濃縮液)
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65
ml
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常溫
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緩沖液WB(濃縮液)
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30
ml
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常溫
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洗脫緩沖液EB
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15
ml
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常溫
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蛋白酶K
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1.05
ml
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-20℃
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RNase
A
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220
μl
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-20℃
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吸附柱CG（含收集管）
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50套
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常溫
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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● 儲(chǔ)存條件和效期：
室溫保存，12個(gè)月內(nèi)有效。緩沖液IL與緩沖液 IB可能有沉淀產(chǎn)生，37℃水浴溶解后即可。RNase
A和蛋白酶K常溫運(yùn)輸，-20℃保存。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
該試劑盒采用獨(dú)特的裂解液能夠有效除去多糖多酚等，能夠從昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、蛔蟲(chóng)等樣品中提取DNA，保存在醇類的樣品也適用于本試劑盒的提取。一次操作可以處理小于50mg組織，樣品經(jīng)裂解液消化，氯仿分離除去大部分的多糖多酚，再經(jīng)分離柱進(jìn)一步純化，便可得到高純度的DNA。所得的DNA可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實(shí)驗(yàn)。
● 準(zhǔn)備工作：
1. 準(zhǔn)備65℃水??；無(wú)水乙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管
2. 按照標(biāo)簽所示在緩沖液IB中加入異丙醇，在DNA Wash Buffer和緩沖液WB中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存?zhèn)溆谩?
3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液IL，緩沖液IB是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在常溫下離心。
1. 液氮充分研磨樣品。
2. 收集研磨成粉末的50
mg樣品，置于1.5ml離心管中。
3. 加入350 μl65℃預(yù)熱的緩沖液 IL，并加入20 μl 蛋白酶K劇烈地漩渦振蕩，確保所有的組織團(tuán)都分散均勻。
4.65℃水浴20-30min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次。
5. 加入300 μl緩沖液LF，充分混勻，12,000 rpm (~13,400×g )
離心5分鐘。
6. 小心地把上清液吸至另一新的1.5ml離心管中。注意確保不要打散沉淀團(tuán)或把組織碎片也一起轉(zhuǎn)移。
7. 加入4 μl
RNase A，渦旋混勻。常溫放置2min。
8. 加入等體積的緩沖液
IB（請(qǐng)確保已經(jīng)按照標(biāo)簽加入異丙醇），充分混勻。如：向300μl上清中加入300 μl 緩沖液 IB。
9. 把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到吸附柱CG上。10,000×g離心1
min以結(jié)合DNA，棄去濾出液體。純化柱最大容量為750 μl,如果混合液大于750 μl,請(qǐng)分兩次過(guò)柱。
10. 將吸附柱重新套回收集管中，加入500μl
緩沖液WB（請(qǐng)確保已經(jīng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇）至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；
11. 將吸附柱重新套回收集管中，加入600μl
DNA Wash Buffer（請(qǐng)確保已經(jīng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇）至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；
注意：DNA
Wash Buffer使用前須按要求用無(wú)水乙醇稀釋。如果放入冰箱中，使用前須恢復(fù)到室溫。
12.再加入600 μl
DNA Wash Buffer（請(qǐng)確保已經(jīng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇）至柱子中，8,000×g離心1min,棄去流出液；
13. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，最大轉(zhuǎn)速（>13000×g）離心空結(jié)合柱1min以干燥柱子的基質(zhì)；這一步對(duì)下面的洗脫步驟至關(guān)重要。
14. 將柱子置于1.5
ml滅菌離心管，加入50-150 μl 65℃預(yù)熱的洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央。常溫靜置5 min；
15. 常溫下，離心(>13000g)1min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲(chǔ)于-20℃。
● DNA濃度及純度檢測(cè)：
基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23 kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
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常見(jiàn)問(wèn)題
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可能原因
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建議
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堵柱子
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轉(zhuǎn)移裂解上清時(shí)，轉(zhuǎn)移了沉淀
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按說(shuō)明書(shū)操作，緩沖液LF分離后，確保不轉(zhuǎn)移到沉淀
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樣品太粘稠
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樣品量別超過(guò)說(shuō)明書(shū)上所說(shuō)的，或者增加緩沖液IB的用量。
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低濃度的DNA量
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樣品的破壁方式不對(duì)
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不論新鮮還是干燥樣品，在加入緩沖液IL之前必須用適當(dāng)方式的研磨成粉末。
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樣品的裂解效果不好
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減少樣品量，或者增加緩沖液IL的用量。
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DNA殘留在柱子上
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增加洗脫液EB的用量，并在離心洗脫前將洗脫液EB65℃孵育5min。
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DNA洗滌不當(dāng)
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DNA
Wash Buffer按說(shuō)明書(shū)用無(wú)水乙醇稀釋。
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下游應(yīng)用不好
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提取的DNA含鹽量高
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DNA
Wash Buffer必須按要求用無(wú)水乙醇稀釋，必須常溫放置。
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提取的DNA含有乙醇
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洗脫前，必須最高轉(zhuǎn)速空甩柱子1 min。
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